一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)， 即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高 細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方 法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

二、實(shí)驗(yàn)方法

材料：

小鼠，生理鹽水，100ml滅菌燒杯，15ml離心管，培養(yǎng)皿，滴管，無(wú)菌鑷子、剪刀，篩網(wǎng)，泡沫板，大頭針，酒精燈，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng) 液，PBS，0.25%胰酶，超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡，顯微鏡，計(jì)數(shù)板，離心機(jī)，恒溫水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，凍存管，凍存液，廢液缸等。

方法：

（1）原代培養(yǎng)：

1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺(tái)內(nèi)，固定在泡沫板上。

2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開(kāi)皮膚一個(gè)橫切口，將皮膚向上撕開(kāi)，然后剪開(kāi)肌肉等，暴露出腹腔，在左側(cè)找到脾臟，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次，并剔除多余無(wú)用的組織。

4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨，同時(shí)不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。

5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中，離心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻，取樣計(jì)數(shù)。

7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。

面做好標(biāo)志，注明細(xì)胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）傳代培養(yǎng)：

1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代。

2.培養(yǎng)液瓶打開(kāi)后，過(guò)酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍。

3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過(guò)火，放入培養(yǎng)液瓶中。

4.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口過(guò)火，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。

5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄蓋滿一層為宜，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基。

6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

7.對(duì)半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

（3）凍存：

1.吸取傳代后的細(xì)胞懸液，離心，去除培養(yǎng)液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為（5～10）×106個(gè)/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細(xì)胞）。

2.按步凍存

o冷凍保存方法一：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。

o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長(zhǎng)期保存。

（4）復(fù)蘇：

1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。